1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞
3T3-L1原代小鼠胚胎成纤维细胞购自美国模式培养物保藏所（American type culture collection, ATCC）。
1.1.2 实验药品及试剂
川芎嗪（TMP, Sigma 95162），人参皂苷Re（Ginsenoside Re, Sigma 77960），白桦脂醇（Betulin, Sigma B9757）。
H-DMEM细胞培养基（HyClone, SH30022），胎牛血清（FBS, Gibco 10099141），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （IBMX, Sigma I5879），胰岛素（Sigma I5500），地塞米松（DEX, Sigma D1756），磷酸缓冲盐溶液（PBS, HyClone SH30256），葡萄糖检测试剂盒（Sigma, GAGO20），CCK-8试剂盒（YEASEN 40203ES60），TRIzol Reagent（Invitrogen15596-026），Prime Script RT Master Mix（TaKaRa RR036A），SYBR Premix Ex Qaq II（TaKaRa RR420A），NuPAGE MOPS SDS Running Buffer （20×）（Thermo NP0001），iBlot Transfer Stack, Regular （Thermo IB301001），β-actin抗体（中杉金桥TA-09），GAPDH抗体（中杉金桥TA-08），SREBP-1抗体（Abcam ab28481），FAS抗体（Abcam ab22759），NUPAGE 4-12%梯度预制胶（Invitrogen NP0321BOX），SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（Thermo 34905）。引物序列（上海生工）：β-actin F 5′-CCATGTACGTAGCCATCCAG-3′；β-actin R 5′-GAGTCCATC ACAATGCCTGT-3′；SREBP-1c F 5′-TTGTGGAGCTCAAAGACCTG-3′；SREB P-1c R 5′-TGCAAGAAGCGGATGTAGTC-3′；FAS F 5′-AGTGCAAGTGCAAAC -CAGAC-3′；FAS R 5′-CATAGGCGATTTCTGGGACT-3′；IRS-1 F 5′- ATTAAAC-ACTGGGCCTCTGG-3′；IRS-1 R 5′- GCTGTGCCATACTCTCTCCA-3′；SOD mouse F 5′-AGGCTGTACCAGTGCAGGAC-3′；SOD R 5′- AGCAGTCACATTG CCCAGGT-3′；HIF-1α F 5′- TCAGCATACAGTGGCACTCA-3′；HIF-1α R 5′- GGTTAAGGCTCCTTGGATGA-3′。其他试剂还包括二抗、胰蛋白酶、DEPC水、异丙醇、TBST缓冲液 (10×)、二甲基亚砜（DMSO）等。
1.1.3 实验仪器
低氧装置Modular Incubator Chamber（MIC-101）（Billups-rothenberg），氧电极（Billups-rothenberg），超净工作台（Thermo），C
O2 恒温细胞培养箱（Thermo），细胞计数仪（Merck&Millipore），离心机（Thermo），光栅型多功能酶标仪（Tecan），紫外分光光度计（Biophotometer），梯度PCR仪（Thermo），qPCR仪（ABI7500），iBlot Dry转膜仪（Thermo），数码凝胶成像系统（BINTA），智能型倒置荧光显微镜（Leica）等。1.2 实验方法
1.2.1 3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞诱导分化
诱导3T3-L1成纤维细胞分化为成熟的3T3-L1脂肪细
胞[13] 。3T3-L1细胞生长至接触融合后2 d，换分化液I（由完全培养基加0.5 mmol·L-1 IBMX、5 μg·mL-1 胰岛素、1 μmol·L-1 DEX组成）培养48 h，再换成分化液II（由完全培养基加5 μg·mL-1 胰岛素组成）继续培养8-11 d，每2 d换液1次。油红O染色法验证3T3-L1脂肪细胞的分化情况。1.2.2 IR-3T3-L1脂肪细胞模型的建立
首先建立IR-3T3-L1脂肪细胞模
型[14] 。3T3-L1细胞分化为成熟的3T3-L1脂肪细胞后，用含DEX 1×10-6 mol·L-1 的完全培养基诱导处理96 h。葡萄糖氧化酶法（GOD-POD法）检测培养基葡萄糖水平，qPCR检测3T3-L1脂肪细胞胰岛素受体底物-1（Insulin receptor substrate, IRS-1）mRNA表达水平，以判断IR脂肪细胞模型的建立。1.2.3 IH+IR-3T3-L1脂肪细胞模型的建立
应用课题组前期摸索的细胞IH刺激方
案[15] ，按如下步骤进行IH处理：①IR-3T3-L1脂肪细胞换无FBS的H-DMEM培养基，37℃细胞培养箱培养0.5 h。②低氧装置MIC-101紫外照射消毒。③将细胞培养皿放入低氧装置MIC-101中：缺氧阶段以低氧气洗脱装置仓中的空气，气体出口以氧电极监测氧浓度，当氧浓度达到5%时停止进气，关闭进气口及出气口，维持低氧状态1 min；复氧阶段将氧气通入装置仓中，当氧电极监测出气口氧浓度达到21%后停止进气，关闭进气口及出气口，维持空气氧浓度5 min；如此循环往复，处理IR-3T3-L1脂肪细胞，缺氧操作及缺氧周期示意如图1。根据前期实验结果，IH循环32次时，SREBP-1蛋白的表达水平明显增高最明显（P < 0.05）（图2），因此我们此次研究中给予IR-3T3-L1脂肪细胞IH循环32次。1.2.4 益气活血中药单体适宜干预浓度的分别筛选
（1）人参皂苷Re适宜干预浓度筛选
人参皂苷Re溶于DMSO配制成5 μmol·m
L-1 的Re原液。分别用含人参皂苷Re 0 μmol·L-1 、1 μmol·L-1 、10 μmol·L-1 、100 μmol·L-1 、500 μmol·L-1 的培养基处理IR-3T3-L1脂肪细胞24 h，采用CCK-8法检测细胞活性，以筛选细胞适宜的Re浓度用于下一步实验。将IR-3T3-L1脂肪细胞分为如下几组进行不同方式的处理：①常氧对照组（Con-Re）：将培养基换为无FBS的H-DMEM培养基，培养箱中常规培养4 h。②模型组（IH-Re）：将培养基换为无FBS的H-DMEM培养基，置于低氧装置MIC-101内，IH循环32次。③人参皂苷Re不同浓度组（Re0、Re1、Re10、Re100、Re500）：根据细胞活性检测结果，选择对细胞活性无明显影响的Re浓度，分别用含Re 0 μmol·
L-1 、1 μmol·L-1 、10 μmol·L-1 、100 μmol·L-1 、500 μmol·L-1 的培养基预处理IR-3T3-L1脂肪细胞模型24 h，然后将培养基换为无FBS的H-DMEM培养基，置于低氧装置MIC-101内，IH循环32次。（2）TMP适宜干预浓度筛选
TMP溶于DMSO配制成10 μmol·m
L-1 的TMP原液。分别用含TMP 0 μmol·L-1 、1 μmol·L-1 、10 μmol·L-1 、100 μmol·L-1 、1000 μmol·L-1 、10000 μmol·L-1 的培养基处理IR-3T3-L1脂肪细胞24 h，采用CCK-8法检测细胞活性，以筛选细胞适宜的TMP浓度用于下一步实验。将IR-3T3-L1脂肪细胞分为如下几组进行不同方式的处理：1）常氧对照组（Con-TMP）：同上。2）模型组（IH-TMP）：同上。3）TMP不同浓度组（TMP0、TMP1、TMP10、TMP100、TMP1000）：根据细胞活性检测结果，选择对细胞活性无明显影响的TMP浓度，分别用含TMP 0 μmol·
L-1 、1 μmol·L-1 、10 μmol·L-1 、100 μmol·L-1 、1000 μmol·L-1 的培养基预处理IR-3T3-L1脂肪细胞模型24 h，然后将培养基换为无FBS的H-DMEM培养基，置于低氧装置MIC-101内，IH循环32次。1.2.5 益气活血中药单体联合适宜干预浓度筛选
经1.2.4所述步骤筛选出人参皂苷Re及TMP分别的可能有效浓度组成4种不同益气活血中药单体浓度组合：①Re1 μmol·
L-1 + TMP1 μmol·L-1 、②Re1 μmol·L-1 + TMP10 μmol·L-1 、③Re10 μmol·L-1 + TMP1 μmol·L-1 、④Re10 μmol·L-1 + TMP 10μmol·L-1 ，重复上步实验筛选最适人参皂苷Re联合TMP干预浓度。分别配制成含有①Re1 μmol·
L-1 + TMP1 μmol·L-1 、②Re1 μmol·L-1 + TMP10 μmol·L-1 、③Re10 μmol·L-1 + TMP1 μmol·L-1 、④Re10 μmol·L-1 + TMP 10 μmol·L-1 ，的4种培养基。将IR-3T3-L1脂肪细胞分为如下几组进行不同方式的处理：1）常氧对照组（Con-Re+TMP）：同上。2）模型组（IH-Re+TMP）：同上。3）Re+TMP不同浓度组（Re1+TMP1、Re1+TMP10、Re10+TMP1、Re10+TMP10）：分别用上述①②③④4种培养基预处理IR-3T3-L1脂肪细胞模型24 h，然后将培养基换为无FBS的H-DMEM培养基，置于低氧装置MIC-101内，IH循环32次。1.2.6 益气活血中药单体联合干预效应及机制研究
SREBPs抑制剂为Betulin，将Betulin溶于DMSO配制成6 mg·m
L-1 的Betulin原液；经1.2.5筛选出适宜的人参皂苷Re联合TMP干预浓度作为益气活血中药单体联合干预浓度。将IR-3T3-L1脂肪细胞分为如下几组进行不同方式的处理：1）常氧对照组（Con）：同上。2）模型组（IH）：同上。3）抑制剂组（Betulin）：Betulin以3 μg·m
L-1 浓度加入到培养基预处理24 h，将培养基换为无FBS的H-DMEM培养基，置于低氧装置MIC-101内，IH循环32次。4）益气活血中药组（Re + TMP）：以含Re1 μmol·L-1 、TMP10 μmol·L-1 的完全培养基预处理24 h，将培养基换为为无FBS的H-DMEM培养基，置于低氧装置MIC-101内，IH循环32次。1.2.7 指标检测
qPCR法检测目的基因SREBP-1c、FAS及炎症、氧化应激等其他指标包括IRS-1、白介素6（Interleukin, IL-6）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的mRNA表达水平。Western-blotting法检测目的蛋白SREBP-1、FAS的表达水平。
1.3 统计方法
计量资料用均数±标准差（
2 实验结果
2.1 IH+IR-3T3-L1脂肪细胞模型的建立
3T3-L1成纤维细胞分化至第8-11 d，细胞分化率可达到80%以上，认为分化成熟，用于下一步实验（图3）。GOD-POD法检测DEX处理96 h后培养基葡萄糖水平高于未用DEX处理组（P < 0.05）（表1），qPCR检测DEX处理96 h后3T3-L1脂肪细胞IRS-1 mRNA表达水平较对照减低（P < 0.05）（图4），认为IR-3T3-L1脂肪细胞模型成立。
2.2 益气活血中药单体的可能合适干预浓度筛选
在IR-3T3-L1脂肪细胞模型基础上加以药物干预及IH处理，筛选适宜的药物干预浓度。
2.2.1 人参皂苷Re及TMP的可能合适干预浓度
CCK-8法测得的OD值比较如表2所示：不同浓度人参皂苷Re细胞活性差异不大（P > 0.05）；而TMP浓度达到10000 μmol·
L-1 细胞活性下降，与其他各浓度比较差异有统计学意义（P < 0.05）。2.2.2 人参皂苷Re对SREBP-1c mRNA表达水平的影响
qPCR法检测及比较Con-Re、IH-Re、Re0、Re1、Re10、Re100、Re500各组IR-3T3-L1脂肪细胞SREBP-1c mRNA表达水平。结果如图5所示：IH-Re组SREBP-1c mRNA表达水平较Con-Re组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），Re不同浓度对SREBP-1c表达水平影响不同，其中Re1组、Re10组降低SREBP-1c表达，与IH-Re组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.2.3 TMP对SREBP-1c mRNA表达水平的影响
qPCR法检测及比较Con-TMP、IH-TMP、TMP0、TMP1、TMP10、TMP100、TMP1000各组IR-3T3-L1脂肪细胞SREBP-1c mRNA表达水平。结果如图6所示：IH-TMP组SREBP-1c较Con-TMP组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05），TMP不同浓度均能一定程度下调SREBP-1c表达水平，其中TMP1组、TMP10组与IH-TMP组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 Re联合TMP的可能合适干预浓度
根据以上筛选结果，分别以不同浓度的Re+TMP（① Re1 μmol·
L-1 + TMP1 μmol·L-1 、② Re1 μmol·L-1 + TMP10 μmol·L-1 、③ Re10 μmol·L-1 + TMP1 μmol·L-1 、④ Re10 μmol·L-1 + TMP 10μmol·L-1 ，）预处理IR-3T3-L1脂肪细胞24 h后进行IH处理，qPCR法检测SREBP-1c及其下游的FAS mRNA表达水平，并与常氧处理的Con-Re+TMP组及IH处理的IH-Re+TMP组比较，观察其对SREBP-1c及下游FAS分子的不同干预效应以筛选最合适的联合作用浓度。结果如图7所示：IH-Re+TMP组SREBP-1c、FAS mRNA表达水平较Con-Re+TMP组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Re+TMP不同浓度均能一定程度下调SREBP-1c、FAS mRNA表达水平，其中Re1+TMP10组、Re10+TMP1组SREBP-1c mRNA表达水平与IH-Re+TMP组比较差异有统计学意义（P < 0.05），Re1+TMP10组FAS mRNA表达水平与IH-Re+TMP组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。2.4 益气活血中药单体对IH+IR-3T3-L1脂肪细胞的干预效应
根据上步干预浓度筛选结果，选择浓度为Re1 μmol·
L-1 + TMP10 μmol·L-1 的Re+TMP作为观察浓度。分别比较Con组、IH组、Betulin组、Re+TMP组SREBP-1分子及其下游分子之一的FAS的蛋白表达水平，IRS-1 mRNA表达水平，及IL-6、SOD、HIF-1α等炎症、氧化应激信号分子mRNA表达水平。Western-blotting法检测SREBP-1、FAS蛋白表达水平，结果如图8所示：IH组SREBP-1、FAS蛋白表达水平较Con组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Betulin、Re+TMP能一定程度下调IH刺激下升高的SREBP-1、FAS蛋白表达水平，其中SREBP-1表达与IH组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
图8 Re+TMP对SREBP-1、FAS蛋白表达水平的影响（n = 6）
注：a. 代表性SREBP-1及FAS Western-blotting结果图；b. SREBP-1，与Con组比较 *P < 0.05，与IH组比
较# P < 0.05；c. FAS,与Con比较& P < 0.05IRS-1、IL-6、SOD、HIF-1α mRNA表达水平比较结果如图9所示：IH组IRS-1 mRNA表达水平较Con组降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；Re+TMP组较IH组IRS-1 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。IH组IL-6 mRNA表达水平较Con组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Betulin组、Re+TMP组较IH组差异无统计学意义（P > 0.05）。IH组SOD mRNA表达水平较Con组降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；Re+TMP组较IH组SOD mRNA表达水平明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。IH组HIF-1α mRNA表达水平较Con组明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Re+TMP组较IH组HIF-1α mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。
3 讨论
IR既是CIH引起的重要病理效应之一，又是AS的重要致病因素，在CIH介导的AS过程中可能占有重要地位，是目前研究新的热点之
一[7] 。中医对IH的研究尚处于起步阶段，基础研究较少见；但由于IH属于特殊类型的缺氧，而具有抗缺氧效用的中药数目颇多，因此可以借其抗缺氧效应试用于IH的研究。目前中医中药研究中常见的中药、中药提取物或有效成分等包括丹参、川芎、银杏叶提取物、黄芪、人参、红景天等[16,17,18,19,20,21] ，可看出益气药、活血药在抗缺氧中药中占有重要地位。本研究选择了人参皂苷Re及TMP分别作为益气中药人参和活血中药川芎的代表中药单体，探讨其对IH复合IR的干预效应及机制。本研究首先分别对人参皂苷Re和TMP对细胞活性和SREBP-1c信号分子的抑制作用进行浓度筛选，参考相关细胞研究文
献[22,23,24,25] 所提供的浓度并根据实际实验操作中两种单体的溶解度等因素，分别选择了人参皂苷Re 0 μmol·L-1 、1 μmol·L-1 、10 μmol·L-1 、100 μmol·L-1 、500 μmol·L-1 及TMP 0 μmol·L-1 、1 μmol·L-1 、10 μmol·L-1 、100 μmol·L-1 、1000 μmol·L-1 、10000 μmol·L-1 作为筛选浓度；并对其中效果较好的浓度进行组合，最后选择了对SREBP-1c、FAS mRNA表达抑制作用最强的人参皂苷Re 1 μmol·L-1 和TMP 10 μmol·L-1 作为最优干预药物浓度，发现了人参皂苷Re和TMP配伍在体外具有一定的抑制IH条件下SREBP-1、FAS蛋白表达水平的上调、提高IRS-1及SOD mRNA表达水平、降低HIF-1α mRNA表达水平的效应，即观察到一定的改善IR、氧化应激的效应。人参皂苷Re在改善IR、调节糖脂代谢方面的有效性已得到许多临床研究及基础研究的证
实[26,27] ，且具有改善氧化应激、抗氧化、抑制炎症反应、抑制细胞凋亡等效应[28,29] ，近几年也有研究报道了人参皂苷Re或含Re的人参提取物在人肝肿瘤细胞（HepG2细胞）、3T3-L1脂肪细胞抑制SREBP-1c及其下游FAS等的效应[30,31] 。TMP是作为已长期应用于临床的药物，在改善氧化应激、细胞凋亡、炎症、抗血小板聚集等方面有着较好的作用，因此得到中西医结合防治心血管疾病领域的广泛认可[32,33] 。然而目前的研究都鲜有报道它们对IH引起的损伤效应是否有改善作用，本研究在之前研究者的基础上对此进行探讨，并首次观察了这两种中药单体对IH引起的SREBP-1c及其下游FAS的表达升高的抑制作用。SREBP-1c、IRS-1、HIF-1α之间相互影响，三者均可参与IH与IR的发生发
展[34] ，在既往研究发现的基础上，本研究从细胞实验角度观察了IH及Re+TMP对三者的作用，能在一定程度上解释益气活血中药的单体成分改善IH及IR损伤效应的部分机制，但对三者间相互影响的分子机制仍尚乏探讨，有待于进一步扩展研究。课题组前期的研究在脐静脉内皮细胞观察到了IH有引起IL-6升高的效应[15] ，此次在IR-3T3-L1脂肪细胞同样观察到了这样的作用，但没有观察到Re+TMP有明显的下调IL-6 mRNA表达水平的作用，既往研究中也罕见人参皂苷Re或TMP在离体细胞实验中下调IL-6的报道[35] ，后续研究还可以从在体动物实验角度或其他炎症因子角度进行进一步探索。目前研究已有分别报道人参皂苷Re或TMP对SOD的调节作用[36,37] ，本研究观察到了二者联合作用上调SOD mRNA表达水平的效应，为Re+TMP改善氧化应激作用提供了依据。综上，本研究在建立IH复合IR的3T3-L1脂肪细胞模型的基础上，探讨了SREBP-1c信号分子及其下游的FAS在IH对氧化应激、炎症反应等损伤效应中的作用，可能为进一步发现OSAHS相关心血管疾病的较新的药物干预靶点提供基础研究依据。研究以益气活血常用中药配伍（人参、川芎）的代表成分人参皂苷Re、TMP为干预药物，在细胞水平验证了其效应、探讨了其机制。虽然研究尚处于初步阶段，还有许多不足，但所得的研究结果具有一定的启示意义，值得进一步深化研究，期待为IH相关AS的中药干预提供更有价值的依据。
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摘要
目的 研究益气活血中药单体人参皂苷Re联合川芎嗪（TMP）对间歇性低氧（IH）复合胰岛素抵抗（IR）的3T3-L1脂肪细胞模型的干预效应，并观察SREBP-1c/FAS信号通路在其中的作用。方法 实验采用IH复合IR的3T3-L1脂肪细胞模型，分别以人参皂苷Re及TMP作为干预药物，首先进行中药最优配伍浓度体外筛选，然后选择最优配伍浓度作为干预剂量，观察其对模型细胞SREBP-1c/FAS信号通路的干预效应。结果 人参皂苷Re 1 μmol·
Abstract
Objective To explore the interventional effects of ginsenoside Re combined with Ligustrazine (TMP) on intermittent hypoxia (IH) composite insulin resistance (IR) cell model of 3T3-L1 adipocytes in vitro, and to observe the effect of SREBP-1c/FAS signal pathway. Methods IH composite IR cell model of 3T3-L1 adipocytes was built. The effective components of Chinese medicine of supplementing Qi and activating blood circulation including ginsenoside Re combined with ligustrazine (TMP) were used as intervention drugs. The optimal compatibility concentration of them was screened in vitro, which was selected as the intervention dose to observe the effect on SREBP-1c/FAS signaling pathway in IH composite IR 3T3-L1 adipocytes model. Results The combination the concentration of Re 1 μmol·L-1 with TMP 10 μmol·L-1 inhibited the mRNA expression of SREBP-1c and FAS after IH treatment. The drug inhibited IH-induced upregulation of protein expression of SREBP-1 and FAS, increased the mRNA expression level of IRS-1 and SOD and reduced the mRNA expression level of HIF-1α after IH treatment. Conclusion The study demonstrates the combination of ginsenoside Re and TMP has the effect of inhibiting expression of IH-induced SREBP-1c/FAS pathway in IR-3T3-L1 adipocytes and may have the effect of improving IR and oxidative stress.
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS）是心血管疾病的独立危险因素，可导致以动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）为基础的各种心脑血管事件的发
目前的中医临床及基础研究提示我们，以益气活血为治法，应用具有益气、活血功效的中药，可能对OSAHS、IR、糖脂代谢异常、AS及相关心血管疾病产生综合的、多靶点的干预效
