目的
探讨蛴螬促进激光损伤兔血-视网膜屏障后的修复作用及机理。
方法
30只实验性兔随机分为正常组、模型组、蛴螬组。采用激光损伤血-视网膜屏障动物模型，在屏障损伤后1周及2周两个时相，观察蛴螬对兔血-视网膜屏障损伤修复情况、血-视网膜屏障组织形态结构及神经营养因子受体TrkC、NGF表达的影响。
结果
蛴螬能促进损伤的血-视网膜屏障修复，减轻激光导致的视网膜组织及细胞形态学损伤，促进TrkC、NGF的表达，抑制视网膜细胞增殖与变性，从而改善视网膜功能。
结论
蛴螬可能通过改善视网膜组织能量代谢，清除氧自由基，促进神经营养因子受体的表达，抑制视细胞增殖与变性，起到保护血-视网膜屏障组织结构的作用。
Objective
To explore the role of sputum in promoting the repair of laser-damaged rabbit blood-retinal barrier and its mechanism.
Methods
Thirty rabbits were randomly divided into normal control group, model control group and sputum group. Laser-damaged blood-retinal barrier animal model was used to observe the repair of blood-retinal barrier damage, blood-retinal barrier tissue morphology and neurotrophin receptor TrkC in rabbits at 1 week and 2 weeks after barrier injury. NGF expression and influence.
Results
It can promote the repair of blood-retinal barrier damage, reduce the retinal tissue and cell morphology damage caused by laser, promote the expression of TrkC and NGF, inhibit the proliferation and degeneration of retinal cells, and improve the retinal function.
Conclusions
It may protect the blood-retinal barrier tissue structure by improving energy metabolism of retinal tissue, scavenging oxygen free radicals, promoting the expression of neurotrophin receptors, inhibiting the proliferation of visual cells.
1 实验材料
1.1 实验动物
选用30只健康实验性兔，均为雄性，体重1.8- 2.3 Kg（湖南中医药大学动物实验室提供，合格证号：医动字第20-002号）。
1.2 药品及试剂
蛴螬酸性水解液（参照谭涵宇所用制备方
法 [3] 制取，具体为：蛴螬400 g，清洗10遍以上，浸泡一晚，后洗至无臭味。加蒸馏水5 kg，加37%HCl至pH值为2。高压蒸汽锅蒸2小时。纱布（4-5层）过滤，溶液中加40%NaOH至pH值为6.5-6.8。冷却，隔水加热，浓缩至1600 mL，装瓶，压盖，蒸汽高温灭菌，冷藏保存）、Harris苏木素（湖南中医药大学病理实验室，批号：71020784）、PV9000型二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司，批号：zb-5301）、细胞裂解液（江苏碧云天，批号：P0013）、RIPA蛋白裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2002）、ECL发光试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2014）、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天，批号：P0006）、转移缓冲液（武汉赛维尔生物科技有限公司，G2017）、NGF一抗（武汉博士德生物工程有限公司）、TrkC一抗（武汉博士德生物工程有限公司）、羊抗兔二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GB23303）。1.3 主要仪器及器械
眼科手术显微镜（苏州医疗器械有限公司）、眼底接触镜（苏州医疗器械有限公司）、YZ/3三面镜（苏州医疗器械有限公司）、YZ5F裂隙灯照相机（苏州医疗器械有限公司）、裂隙灯显微镜（苏州医疗器械有限公司）、AG204型电子天平（上海梅特勒—托利多仪器有限公司）、TD5-Ⅱ台式离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）、SSW型电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司）、721分光光度计（上海第三仪器厂）、LKB8800超薄切片机（瑞典LKB公司）、多功能显微镜（西德OPTON公司）、Olympus光学显微镜（日本日立公司）、石蜡包埋机（日本日立公司）、LeicaMPS30照相系统（德国Leica公司）、Leica石蜡切片机（德国Leica公司）、莱特532眼底激光治疗仪（法国光太公司）。
2 实验方法
2.1 激光损伤血－视网膜屏障动物模型的建立
参照王晓
英[4] 、陈少军[5] 等造模方法并加以改进。实验动物的准备：激光照射当日用复方托吡卡胺眼药水滴眼2次。造模方法：兔称重，固定，20%乌拉坦1 g/kg耳缘静脉注射全麻，将兔头部固定于激光机前，以激光在视盘及有髓神经纤维下视网膜处密集照射40个点，光斑紧邻，最大间隔为100 μm。光斑效应为3级（中度~重度）[6] ：中心白较浓或更浓，激光能量作用于内核层。2.2 动物分组及给药方法
30只实验性兔随机抽取10只（20只眼）作为正常组，其余20只（40只眼）造成激光损伤血－视网膜屏障模型，并随机分成模型组、蛴螬组，每组10只（20只眼）。
造模后第2天开始给药，按照“人—动物体表面积等效剂量比值表”折算实验动物的给药剂量，折算公式：W*成人用量（g）/动物体重（kg），折算系数W=0.018，每组灌胃药物详情如下：正常组与模型组以0.9%生理盐水2 mL灌胃，蛴螬组以蛴螬提取液2 mL灌胃，均为每日1次，每次0.56 g/100 g。
2.3 标本采集方法
灌胃1周后，各组随机抽取5只兔进行标本的采集和指标的检测，各组剩余的兔继续同法灌胃至第2周结束，再行标本的采集和指标的检测。
2.3.1 眼球壁标本的采集
实验结束后，动物耳缘静脉注射空气处死，立即沿角膜缘作标记后摘除眼球，生理盐水冲洗干净，在冰生理盐水中于角膜缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节组织和玻璃体，在手术显微镜下找到激光斑所处视网膜，大于激光斑范围约3 mm切除该处眼球壁，用4%多聚甲醛在4℃固定。
2.3.2 视网膜组织匀浆的采集制作
将依同法摘除的眼球壁在手术显微镜下剥离激光斑部位视网膜，用滤纸吸干水分，电子天平称其湿重，再用双蒸水按照湿重：体积=1：19配制成5%的视网膜匀浆液。
2.4 观测指标及其方法
2.4.1 眼底观察及照相
造模后即刻作眼底照相；每日灌胃前用直接检眼镜查看眼底，观察眼底情况，光凝后7天、14天再次眼底照相。
2.4.2 光镜下HE染色观察
经脱水浸蜡，二甲苯溶液脱蜡2次，每次5 min，无水乙醇洗蜡1次，3 min，95%乙醇浸泡，3 min，85%乙醇浸泡，3 min，自来水洗，3 min，苏木素染色，5 min，水洗去多余染液，3 min，75%乙醇盐酸分色5 min，自来水洗蓝化，5 min，1%伊红染色，3 min，水洗去多余染液，3 min，80%乙醇Ⅰ分色脱水，1 min，85%乙醇Ⅱ分色脱水，1 min，无水乙醇Ⅰ脱水，1 min，二甲苯溶液透明，3 min，中性树胶封片等步骤，在光学显微镜下观察HE染色标本视网膜各层结构的形态学变化。
2.4.3 神经营养因子受体蛋白（TrkC、NGF）表达的免疫组化观察
采用S-P免疫组化法检测视网膜组织的TrkC、 NGF表达：石蜡切片经常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后切片，3%
H2 O2 去离子水孵育5-10分钟，阻断内源性过氧化酶，PBS根据需要对组织切片进行预处理，滴加兔来源的一抗，37℃孵育1-2小时，PBS冲洗，2分钟×3次，滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20-30分钟，PBS冲洗，2分钟×3次，选用DAB显色，蒸馏水充分冲洗，选择适当的封片剂进行封片，高放大倍率显微镜下观察TrkC、NGF的表达。标准如下：免疫组织化后，细胞质为棕色或深棕色为阳性标记，使用高倍显微镜随机选择5个视网膜视野用于图像分析系统的分析。2.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差（
3 结果
3.1 眼底照相
造模组与蛴螬组均有明显激光斑，激光斑中心颜色呈浓白色，周边见浅色一圈光晕，说明造模成功。造模后7天，蛴螬组激光斑色白，边界尚清，未见中心色素形成，可见白点，少许玻璃体混浊；模型组激光斑呈白色，边界较模糊，中心未见色素沉着，玻璃体混浊。造模后14天，蛴螬组激光斑范围明显缩小，大部分形成瘢痕组织，玻璃体少量混浊；模型组激光斑颜色变深，中心形成瘢痕组织，玻璃体仍见明显混浊，说明出血未完全吸收。（图1,2,3,4,5,6）
3.2 HE染色
3.2.1 术后1周HE染色观察
正常组视网膜色素上皮层、视杆视锥层、外核层、外从状层、内核层、内从状层、神经节细胞层、神经神经纤维层等各层结构清晰正常（图7）。模型组视网膜厚度显著薄于正常组，组织结构紊乱，细胞数目减少，视细胞萎缩变性，HE染色可见视网膜色素上皮细胞不连续，视网膜的外层较薄，部分感光细胞形态欠规则，且细胞核数量减少，大部分区域无外感光器核染色，一小部分区域可见聚集成团的细胞核染色（图8）。蛴螬组视网膜厚度明显高于模型组，可以见到一部分视网膜色素上皮，感光细胞核的数量大于模型组，外从状层、外核层、视杆视锥层的结构厚于模型组，并且结构更清晰（图9）。
3.2.2 术后2周HE染色观察
正常组较前无明显变化。模型组视网膜厚度仍薄于正常组，视网膜组织细胞数目较前增多，结构较前清楚（图10）。蛴螬组视网膜厚度高于模型组，视网膜结构清晰，排列整齐（图11）。
3.3 TrkC的表达
3.3.1 术后1周TrkC的表达
正常组视网膜组织抗TrkC标记的细胞浅染色，染色阳性主要位于外核层细胞（图12），模型组视网膜组织TrkC在Müller细胞中呈阳性表达（图13），蛴螬组视网膜组织TrkC呈强阳性表达，阳性面积大，染色较深（图14）。模型组、蛴螬组TrkC表达与正常组比较有显著性差异（P<0.01）。见表1。
3.3.2 术后2周TrkC的表达
正常组视网膜组织TrkC呈弱阳性表达，与1周前正常组无区别（图15），模型组视网膜组织TrkC呈弱阳性表达，Müller细胞中着色较正常组深（图16），蛴螬组视网膜组织TrkC呈弱阳性表达，可见少量阳性染色位于Müller细胞中（图17）。各组TrkC表达均较1周前有所下降，蛴螬组与模型组之间有显著性差异（P<0.01）。见表1。
3.4 NGF的表达
3.4.1 术后1周 NGF的表达
正常组视网膜组织 NGF染色呈阴性（图18），模型组视网膜组织 NGF呈阳性表达，主见于外核层Müller细胞外侧端表达（图19），蛴螬组视网膜组织 NGF呈强阳性表达，但阳性部位多位于Müller细胞的外侧端（图20）。模型组与蛴螬组NGF表达均高于正常组且有显著性差异（P<0.05），蛴螬组与模型组间有显著性差异（P<0.05）。见表2。
3.4.2 术后2周 NGF的表达
正常组视网膜组织 NGF染色呈阴性（图21），模型组视网膜组织 NGF呈弱阳性表达，主要位于神经节细胞层（图22），蛴螬组视网膜组织 NGF呈阳性表达，主位于Müller细胞外侧端及部分神经纤维层，染色较其它组深，阳性面积较其余对照组大（图23）。模型组、蛴螬组NGF表达均较1周前有所下降，模型组与正常组间比较有显著性差异（P<0.05），蛴螬组表达高于模型组，并且有显著性差异（P<0.05）。见表2。
4 讨论
随着激光对血－视网膜屏障损伤机理研究的不断深入，对于损伤后的治疗，国内外已经从简单的抗炎、止痛等对症治疗转向探索更有针对性的治疗方法，目前研究的重点主要集中在激素类、神经保护剂和某些细胞因子的应用研究。激素类主要是通过抑制视网膜细胞的脂质过氧化反应，维持细胞完整性，防止细胞内物质外流
[6] ，在激光照射后短时间内具有神经保护作用，但是对长期损伤没有治疗作用。碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor, bFGF）和重组人碱性成纤维细胞生长因子（Recombinant human basic fibroblast growth factor, rhbFGF）可加速视网膜损伤斑的修复愈合、维持神经元和胶质细胞的功能以及视功能的恢复[7,8] ，对激光视网膜损伤斑有明显的促进修复愈合作用，可使损伤斑变浅淡，色素沉着减少，视网膜损伤斑面积明显缩小，愈合修复较快。二甲基硫脲（Dimethyl thiourea，DMTU）可以有效地抑制感光细胞的脂质过氧化，能明显减少损伤区域视网膜神经元的凋亡数目，保护视网膜组织的结构和形态[9] 。目前神经细胞保护剂尚处于研究、实验阶段，其作用和不良反应正在探索之中。尽管新的视网膜光损伤治疗方法不断问世，但很多都处于起始阶段，其使用方法和疗效有待进一步的研究和证明，在临床上尚缺乏有针对性的有确切疗效的西药。目前的主要治疗原则是：撤离照射环境，及时对症处理，营养支持治疗，促进组织修复，缩短致伤病程，恢复功能状态。如加强全身营养，补充富含多种维生素的食物，增强机体抵抗力等，有利于调节眼内的正常代谢，增强局部抗损伤能力。在祖国医学文献中并无“激光损伤血－视网膜屏障”病名的记载，但早在《备急千金药方·卷六·七窍门上》中就记载了“…数看日月、夜视灯火…，并是丧明之本”；《外台秘要》进一步提到“数向日月轮看”、“雪山巨睛视日”皆是“丧目之由”，明确提出光损伤对视力的损害。现代中医眼科在继承传统医学的基础上，将激光损伤归为:“为物所伤之病”范畴，认为激光致血－视网膜屏障损伤主要是由于热灼阴津、热灼血络，气津相关，气能生津、化津、摄津，津能载气，若阴津亏耗，无以载气，则气失依附而气散气耗而致气虚；气生于精，精化为气，阴精亏耗必致气虚；阴损耗气而致气阴两虚，气为血帅，气行血行，若气虚运血无力，可致气虚血瘀。
蛴螬是金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子或其他近缘昆虫的干燥幼虫，属虫类药，味咸微温，有毒。有破血、行瘀、散结、通乳之功效，《神农本草经》中最早有记载：“主恶血血瘀痹气，破折血在胁下坚满痛，月闭，目中淫肤、青翳白膜。”《别录》称蛴螬可以“疗吐血在胸腹不去及破骨踒折血结，金疮内塞，产后中寒，下乳汁。”《本草拾遗》中记载蛴螬“主赤白游疹，疹擦破，碎蛴螬取汁涂之。”现代研究认为蛴螬含有多种对人体健康有益的元素：蛴螬中Ca、Mg、Cr、Fe、Zn 的含量高是其重要的营养特征，Cu、Mn含量也非常丰富，蛴螬中K/Na 的高比值对于防治心脑血管疾病有重要意义。从蛴螬中维生素含量测定结果看，B族维生素含量较高，维生素A和维生素E的含量也较丰富。维生素B1和烟酸能促进血液循环，维生素B2能缓解眼睛疲劳、预防白内障，维生素A有增强机体免疫功能的作用,维生素E是抗氧化维生素。对蛴螬滴眼液中氨基酸成分的测定结果显示，其含有大量天门冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸等氨基酸，与Zn、Fe、维生素E等作用，可以缓解组织缺氧缺血，可能对血-视网膜损伤后组织的修复产生保护作用。
有研究发现视网膜组织光损伤可导致感光细胞的存活率下
降[10,11] ，这与神经营养因子（Neurot rophic factors，NTFs）有很大关系，NTFs在神经系统发育过程中的生长、生存以及成熟都是必不可少的[12] 。神经生长因子（Nervegrowthfactor，NGF）是NTFs蛋白家族的一员，在视皮质中的NGF能稳定丘脑传入的突触接触[13] ，成熟NGF和NGF原蛋白（proNGF）的免疫反应性出现在大鼠视网膜神经节细胞（RGC）、视网膜色素上皮细胞(RPE)以及与内界膜相邻的视网膜区域，有研究推测NGF可能在正常视网膜功能执行中发挥作用[14] ，在视网膜神经节细胞、RPE细胞中均具有NGF受体[15] 。NTFs作用主要是通过高亲和型酪氨酸蛋白激酶类受体（High-affinity tvrosine kinase receptors，Trks）和p75神经营养素受体（The low-affinity neurotrophin receptor，p75NTR）完成的。当NGF与Trks结合后，胞外区构象变化导致受体的寡聚化活化，使胞内区的酪氨酸激酶活性增高，然后通过Ras通路激活Raf21蛋白，随后在细胞质中促分裂因子激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）等一系列激酶被活化后的信号转移到细胞核内，并作用于一系列的靶蛋白（包括转录因子），从而影响基因的转录和翻译，表现为对细胞生长的调控，这样NGF通过TrkC就可以转变为细胞生长分化信号，从而使NGF表现出多种生物功能[16] 。本实验发现激光损伤视网膜血-视网膜屏障时NGF与Trks同时表达，而蛴螬能有效上调NGF与TrkC的表达，从而抑制视网膜细胞的凋亡，保护细胞正常功能。提示蛴螬对激光所致视网膜血-视网膜屏障损伤有保护作用，能促进损伤后视网膜组织结构的恢复，维护正常视功能。
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摘要
Abstract
Keywords
Grub; laser; blood-retinal barrier (BRB); neurotrophin receptor (TrkC; NGF)
随着激光在眼科检查及治疗的广泛应用，由激光所致的医源性视网膜光损伤也越来越多，视网膜光损伤会破坏视网膜屏障功能，许多眼科疾病的发生与视网膜长期光照的积累效应有
