目的
采用网络药理学方法探讨失笑散的功效物质基础对子宫内膜异位症痛经方面的作用机制。
方法
依托TCMSP数据库检索失笑散中五灵脂，BATMAN-TCM数据库检索失笑散中蒲黄相关的所有化学成分，整合作用靶点预测（STPD），进而构建化合物-靶点网络图；通过Gene Cards、DisGeNET数据库筛选子宫内膜异位症痛经相关的靶点，进而构建疾病靶点相互作用网络图；筛选药物靶点和疾病靶点相互作用图的核心靶点。采用DAVID数据库对失笑散作用靶点进行生物功能及代谢通路分析。
结果
选择筛选出失笑散中的15个活性成分，共涉及225个作用靶点；通过网络拓扑特征评价筛选出与失笑散在子宫内膜异位症痛经方面作用的核心靶点41个，主要通过癌症通路、粘着斑、丝裂原活化蛋白激酶、细胞凋亡、NOD样受体、T细胞受体信号通路发挥对子宫内膜异位症痛经的治疗作用。
结论
通过网络药理学验证了失笑散多成分、多靶点、整体调节的作用特点，预测了失笑散在子宫内膜异位症痛经中的主要作用机制，为其活性成分研究和实验研究提供理论依据。
Objective
Network pharmacology method was adopted in this study to explore the active compounds and mechanism of Shixiao Powder for angiogenesis.
Methods
Chemical components and targets related to the four traditional Chinese medicine (TCM) herbs were searched through the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) and BATMAN-TCM，and then integrating target prediction database (STPD). Compound-target network were constructed to explore the mechanism of Shixiao Powder. Through DisGeNET database and Gene database, the targets of endometriosis dysmenorrhea were selected, and then the network diagram of disease-target interaction was constructed; The nuclear target of drug target and disease target interaction diagram was screened, DAVID was used to carry out GO analysis of the nuclear target, and KEGG database was used to carry on the related pathway enrichment of the nuclear target.
Results
Selecting the oral bioavailability (OB) ≥ 30% and drug likeness (DL) ≥ 0.18 as filter condition, 15 active ingredients and 225 corresponding protein targets were screened from Shixiao Powder. Through the evaluation of network topological characteristics, such as degree, medium degree, and proximity to the center, 41 targets were selected to serve as the nuclear target in atherosclerosis. The KEGG database was used for the enrichment of the selected targets, including Cancer pathway, focal adhesion, mitogen-activated protein kinase, apoptosis, NOD-like receptor, T-cell receptor signaling pathway which were screened which had effect on endometriosis dysmenorrhea.
Conclusion
This study revealed the main active compounds and possible mechanism of Shixiao Powder for treatment of angiogenesis and verified the characteristics of multi-components, multi-targets, and integral regulation for Shixiao Powder, predicting the main possible mechanism for the treatment of endometriosis dysmenorrhea, which provided theoretical basis for the study of active ingredients and experimental research.
1 材料与方法
1.1 失笑散化学成分信息的收集
通过TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）收集到失笑散中药蒲黄的化学成分进行活性筛选，该数据库共收集了《中华人民共和国药典》记载的499味中药材，包含了12144种化学成分。另外，依据药物ADME（吸收、分布、代谢及排泄）特性。选取同时满足阈值OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18的成分作为潜在的活性成分，同时通过BATMAN-TCM数据库查找五灵脂的化学成分进行活性筛选，该数据库通过相似产物靶点相近的原理，用留—法互作交叉验证进行了预测的验证，用已验证过的化合物与蛋白的互作作为金标准，来对互作进行验证。并通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以及查阅文献获得这些成分的化学结构，并保存为Smiles格式。
1.2 靶点的选择
将筛选得到的潜在活性分子的Smiles结构导入Swiss Target Prediction（http://www.swisstarget-prediction.ch/）数据库。在靶点预测中，3D相似性阈值设置为0.75，2D相似性阈值设置为0.45，由此获得与活性成分最相关的靶点信息。挖掘失笑散中的成分、及对应的潜在靶点，并用Cytoscape 软件构建成分-潜在靶标网络。利用Gene Cards（http://www.genecards.org/）和DisGeNET（http://www.disgenet.org/）搜索关键词子宫内膜异位症（endometriosis）和痛经（dysmenorrhea），合并2个数据库，去除重复和假阳性的基因，最后与活性成分相关的靶点相映射，获得失笑散活性成分的潜在作用靶点。
1.3 PPI网络构建与关键靶标的筛选
根据以上预测结果，蛋白互作网络（PPI）是系统网络生物学重要研究内容，蛋白相互作用是细胞、组织的功能的基础，在机体的生理和病理上起到重要的作用。相互作用网络的构建以String数据库（https://string-db.org/）用来分析已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。将失笑散活性成分作用靶点导入String数据库，限定研究物种为人类，获得蛋白互作关系，并将该文件中 node 1、node 2和Combined score信息导入Cytoscape 软件绘制蛋白互作网络，并得到网络分析结果。利用“Network Analyzer”模块分析PPI网络的拓扑属性参数，选取度（degree）和介度中心度（betweenness）同时在平均数之上的靶标为“关键靶标”，研究关键靶标可能的药理作用。因其两个为主要拓扑参数。
1.4 靶点生物功能注释分析
DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）是高通量的生物数据功能分析挖掘工具，将获得的失笑散化合物潜在作用靶点导入功能注释工具，限定研究物种为人类，选择Gene Ontology下的分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组成（cellular component，CC）3个部分分析，选择 Pathway 分析中KEGG Pathway，设定Bonferroni校正P < 0.01，经Kappa算法进一步寻找活性成分作用靶点显著富集的主要功能注释与体内通路。
2 结果
2.1 失笑散活性化合物的筛选
通过数据库检索及文献整理，在TCMSP数据库中，通过OB、DL指标进一步筛选，共收集失笑散的化学成分15个，其中蒲黄8个，五灵脂7个，见表1。
表1 失笑散中15个候选化合物基本信息列表
Table 1 Basic information of 15 candidate compounds of Shixiao Powder
中药 化学成分 英文名 化学式 Pubchem编号 蒲黄 黄杞苷 (2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one C21 H22 O10 2098 蒲黄 花生四烯酸 arachidonic acid C20 H32 O2 444899 蒲黄 异鼠李素 isorhamnetin C16 H12 O7 5281654 蒲黄 β-谷甾醇 beta-sitosterol C29 H50 O222284 蒲黄 山奈酚 kaempferol C15 H10 O6 5280863 蒲黄 棕榈酸睾酮 Testosterone palmitate C35 H58 O3 164765 蒲黄 山奈酚-3-O-β-D-槐糖苷 kaempferol-3-O-α-L-rhamnosyl(1→2)-β-D-glucoside C36 H36 O17 11664897 蒲黄 槲皮素 quercetin C15 H10 O7 5280343 五灵脂 波那拉酮A Ponalactone A C19 H22 O6 442079 五灵脂 尿酸 Uric Acid C5 H4 N4 O3 1175 五灵脂 五灵脂酸 Wulingzhic Acid C20 H32 O5 194979 五灵脂 4'-联苯酚 4'-Dihydroxywogonin C12 H10 O2 52700331 五灵脂 续断皂甙E1 Japondipsaponin E1 C20 H32 O5 53698648 五灵脂 脲 Urea C H4 N2 O1176 五灵脂 三羟基异甾族胆烯酸 Trihydroxy Isosterocholenic Acid C27 H44 O5 50432291 2.2 失笑散化合物—靶点相互作用网络
将潜在活性成分的Smiles格式上传到Swiss Target Prediction数据库，得到所有成分的预测靶点225个。其中，失笑散15个化学成分对应225个潜在靶点，五灵脂的潜在作用靶点有105个、蒲黄120个，利用Cytoscape3.2.1软件将225个化合物与靶点。构建化合物-靶点网络。见图1，在网络中，一个节点的表示网络中和节点相连路线的条数。该网络中，每个化合物的平均靶点数目为15个，每个靶点平均与14.2个化合物相互作用。在靶点中，度值最高的前3位是VEGFA（人血管内皮生长因子A）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）。这体现了失笑散多成分与多靶点之间共同作用的机制，符合中药复方的特点。
2.3 PPI网络与关键靶标分析
将上述作用靶点导入String数据库得到蛋白质相互作用关系，利用Cytoscape软件绘制蛋白关系，分别构建化合物潜在靶点PPI（158个节点，620条边）和子宫内膜异位症痛经靶点PPI（570个节点，11913条边），见图2，靶点以圆形节点表示，颜色越深、节点越大表示degree（代表网络中具有相互作用的蛋白数目）越高。将以上两个PPI网络相交，对网络中所有点的拓扑参数进行分析，选择靶点中每个靶点的度拓扑参数值大于中位数，即度 ≥ 16作为筛选核心靶点的条件，介度中心度大于中位数，即1.12 × 1
0-2 得到41个核心靶点的失笑散与子宫内膜异位症痛经靶点网络图。其中涉及的41个核心靶点见表2。表2 拓扑分析41个核心靶心信息
基因 度（Degree） 介度中心度 基因 度（Degree） 介度中心度 （Gene） （BetweennessCentrality） （Gene） （BetweennessCentrality） VEGFA 85 0.051 AVP 29 0.020 MMP9 47 0.016 IL1B 51 0.019 PIK3CA 90 0.063 ANXA1 42 0.018 ICAM1 41 0.017 CYP1A1 27 0.063 IL6 87 0.056 IGF1 70 0.064 FOS 65 0.057 CYP1A2 22 0.016 IL8 73 0.056 CYP19A1 17 0.016 MAPK1 77 0.054 CCL5 42 0.015 TP53 83 0.111 TGFB1 51 0.015 MAPK3 64 0.049 ADIPOQ 31 0.014 ESR1 40 0.042 CD44 34 0.014 PTGS2 55 0.039 ITGB1 31 0.013 EGFR 68 0.036 CCL2 41 0.013 NCOA1 35 0.034 RELA 51 0.013 CTNNB1 48 0.032 IL10 53 0.012 MED1 34 0.032 NFKB1 60 0.012 AKT1 73 0.031 IL4 47 0.012 PPARG 38 0.024 SHC1 32 0.011 LEP 43 0.023 NCOR1 29 0.011 TNF 66 0.023 PPARA 20 0.011 C3 29 0.021 2.4 关键靶点的通路富集分析
利用DAVID平台对失笑散PPI网络中涉及的41个核心靶点进行GO功能富集分析。根据设定Bonferroni校正P < 0.01，经Kappa算法进一步确定了41个GO条目（见表3），其中生物过程主要涉及高分子生物合成过程的正向调控、生物合成过程的正向调节、高分子代谢过程的正向调节、转录调节与DNA依赖等方面；分子功能主要涉及生长因子活性、转录调节活性、转录因子活性等方面；细胞组成主要涉及细胞外组分、细胞外间隙等方面。表明失笑散的有效成分可能通过作用于这些信号通路来达到调控子宫内膜异位症痛经治疗疾病目的。在KEGG数据库中获得与关键靶点相关通路82条，结果表明失笑散可能主要通过癌症通路（19个靶点）、子宫内膜癌（7个靶点）（见图4）、粘着斑（10个靶点）、丝裂原活化蛋白激酶（11个靶点）、细胞凋亡（7个靶点）NOD样受体（10个靶点）、T细胞受体信号通路（12个靶点）等信号通路（见图3），表明失笑散的活性成分靶点分布于不同的通路，可通过各通路协调发挥作用。
表3 失笑散治疗子宫内膜异位症痛经关键靶标具有的功能信息
类别 GO编号 条目 数目 P 细胞组分 0044421 extracellular region part 12 4.416×1 0-7 细胞组分 0005615 extracellular space 10 3.10×1 0-6 生物过程 0010557 positive regulation of macromolecule biosynthetic process 8 9.15×1 0-6 细胞组分 0005576 extracellular region 14 1.19×1 0-5 分子功能 0008083 growth factor activity 7 1.47×1 0-5 生物过程 0009891 positive regulation of biosynthetic process 8 1.77×1 0-5 生物过程 0010604 positive regulation of macromolecule metabolic process 8 3.88×1 0-5 分子功能 0005125 cytokine activity 8 1.07×1 0-4 生物过程 0031328 positive regulation of cellular biosynthetic process 7 1.74×1 0-4 生物过程 0006355 regulation of transcription, DNA-dependent 8 1.93×1 0-4 生物过程 0051252 regulation of RNA metabolic process 8 1.91×1 0-4 生物过程 0045941 positive regulation of transcription 6 3.47×1 0-4 生物过程 0010628 positive regulation of gene expression 6 6.23×1 0-4 生物过程 0045449 regulation of transcription 8 8.06×1 0-4 生物过程 0045935 positive regulation of nucleobase, nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolic process 6 8.83×1 0-4 生物过程 0051173 positive regulation of nitrogen compound metabolic process 6 1.04×1 0-3 生物过程 0051254 positive regulation of RNA metabolic process 5 1.79×1 0-3 生物过程 0045893 positive regulation of transcription, DNA-dependent 5 1.78×1 0-3 分子功能 0030528 transcription regulator activity 5 0.020 分子功能 0003700 transcription factor activity 4 0.049 3 讨论
网络药理学从整体的角度探索药物与疾病间的关联性，强调从“单靶标”向“网络靶标”研究模式的转变，因此，它与中医药的有机结合是一个富有原创性的研究方
向[16] 。目前，运用多组学技术联合网络药理学和生物信息学的方法来阐释中药多组分在分子水平的协同作用，再结合整体水平中药作用机制的研究，能够帮助更精确地揭示中药的药理学机制[17] 。失笑散中蒲黄、五灵脂两位药具有活血通络，化瘀止痛的功效，在妇科临床疾病的治疗中发挥着重要作用。陈静丽
等[18] 临床发现通过治疗实性轻、中度痛经的临床疗效，经前3 d~5 d至经净给予治疗有效率达到96.67%。王妍等[19] 通过120例观察治疗前后痛经程度及持续时间的变化，发现治疗子宫腺肌病痛经疗效确切。在实验研究表明[20] 失笑散能够明显增强离体子宫的收缩频率，降低全血比黏度，抗血栓形成及镇静、镇痛等作用。刘文粢等发现[21] 失笑散中的Fe、Zn、Mn、Cu、Ni等微量元素具有活血的作用，其中Fe和Cu活血化瘀的作用较大。目前，现代药理研究认为蒲黄、五灵脂具有改善子宫微循环，镇痛，降低毛细血管通透性，减少渗出，影响异位增生的子宫内膜的局部代谢，促使异位内膜退化脱落等作用。本文运用网络药理学方法对其治疗子宫内膜异位症痛经的作用机制做进一步深入研究。本研究系统分析了蒲黄、五灵脂两位中药的有效成分，分析化合物与靶点的相互作用关系。其中化合物—靶点网络中关键药物是山奈酚、槲皮素等，其是蒲黄中的有效成分。根据研究显
示[22] ，槲皮素具有同步抑制卵巢癌细胞生存能力和免疫抑制因子VEGF表达,并且可以诱导细胞凋亡,这其中的机制与Wnt/β-catenin信号通路下调有关。在抗肿瘤方面[23] ，通过抑制Eca109细胞的迁移、侵袭及血管新生；可抑制细胞增殖，调控细胞的附着和侵袭的作用。抑制体外培养的人脐静脉血管内皮细胞（EVC304）生长[24] ；还有减少毛细血管脆性、扩张冠状动脉和增加冠脉血流量等作用。山柰酚是一种具有抗炎并且抗氧化作用的黄酮类化合物；周瑶等[25] 研究发现其抗肿瘤作用明显，高剂量会降低晚期大肠腺瘤的复发，并从体外发现其对小鼠黑色素瘤细胞B16具有增殖抑制作用；还能通过抑制铜离子诱导成为氧化低密度脂蛋白，阻止对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的摄取，有效预防动脉粥样硬化。五灵脂酸[26,27] 在体外有明显的抑制血小板聚集活性，并显示了不同程度的抗菌活性。在化合物-靶点网络中，部分关键化合物分子具有高度的中心性并且应用于妇科领域的研究，雌激素受体（ESR1）、VEGFA（人血管内皮生长因子A）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和细胞间粘附分子-1（ICAM-1）等为关键靶点。VEGFA主要作用是增加小静脉血管与微血管的通透性，因此称为血管通透因子，也称促血管素。临床研究发现，VEGFA在子宫内膜异位症患者的腹膜液中一直被高浓度检测到，其水平似乎与疾病分期有
关[28] 。VEGFA在腹膜内植入物的腺体区室中大量表达，在子宫内膜瘤中，并且由活化的腹膜巨噬细胞分泌[29,30] 。并且它的的表达表现出与卵巢类固醇调节一致的循环相依赖性。MMP和它们的抑制剂（TIMP）参与细胞外基质重塑和环状子宫内膜周转和月经[31,32] 。MMP的月经周期阶段特异性表达提示卵巢类固醇调节。MMP和TIMP之间的平衡对于维持适当的MMP活性水平至关重要，并且不能维持这种平衡可能导致基质分解和细胞侵袭。ICAM-1通过从子宫内膜异位症的潜在机制子宫内膜间质细胞的组成通过脱落这些细胞逃避自然杀伤细胞介导的清除[33,34] 。受损的NK细胞功能可赋予回流的子宫内膜细胞免疫特权状态，从而易患疾病。子宫内膜异位症患者的巨噬细胞功能受损可能进一步导致这种细胞类型的病变清除率降低。MAPK1和MAPK3为主要核心靶点，都同属于MAPK激酶家族，是由多种磷酸基团蛋白构成，可触发一系列的下游信号反应，如参与基因表达、细胞存活和凋亡等多种生理过程。而且MAPK途径的作用与癌症、自身免疫性疾病等多种疾病相关[35] 。Li等[36] 研究发现在子宫内膜异位症患者与对照组的基因差异表达谱中，细胞增殖诱导异位，说明在子宫内膜异位症中同样涉及到MAPK信号通路。加压素(AVP)作为核心靶点，也是五灵脂化合物Urea的靶点，研究发现AVP与子宫内膜异位症痛经密切相关，相对于粗大的血管,子宫肌层小血管对血管AVP的敏感性更大。Williams等[37] 研究证实血管加压素是一种比催产素更强烈的子宫收缩剂，对非孕子宫有较强的刺激作用，尤其在孕激素效应与雌激素受体（ESR1）存在时作用明显。对失笑散的靶点进行PPI映射并构建网络，对网络分析后发现了多个与多种复杂疾病紧密相关的关键靶点，如TP53、IGF1、TNF、PIK3CA、CYP1A1、IL6、FOS、IL8、MAPK1、MAPK3、ESR1、PTGS2、EGFR等，本病多见瘀血内阻，气机不畅病机，治法常以活血化瘀为主，与活血化瘀功效相关的靶点包括ICAM1、MMP-9、TIMP-1和VEGF
A[38,39] 。为了说明作用靶点在基因功能和信号通路中的作用，本研究进行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。发现失笑散主要能够调节高分子生物合成过程的正向调控、生物合成过程的正向调节、高分子代谢过程的正向调节、转录调节与DNA依赖等方面功能。大多数的基因富集到了与癌症有直接关系的通路上，包括癌症通路、子宫内膜癌通路、胰腺癌通路等；另一大部分主要调控信号通路，包括MAPK信号通路、T细胞受体信号通路、细胞凋亡等。Yotova等研究表明[40] MAPK信号传导通路作为交汇点和关键通路，可被多种细胞外刺激通路激活进而参与胞内信息的传递途径。Wu等实验发现雌激素能激活MAPK信号通路，子宫内膜异位症病灶中存在MAPK的高表达，给予鞘内注射抑制剂后可使子宫内膜异位症病灶缩小、神经纤维分布以及疼痛消失[41] 。已有研究显示[42] ，失笑散通过降低丙二醇含量和提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-过氧化物酶活性，调控氧化损伤机制保护血管内皮细胞，保护血管内皮细胞的有效提取物。另外，根据分析结果推断失笑散中的活性成分可能通过作用于与癌症直接相关的通路，从而对多种癌症起到治疗作用。失效散治疗肿瘤和心血管病的机理，可能也存在于治疗子宫内膜异位症痛经中，因为子宫内膜异位症是具有种植、浸润、广泛转移等恶性肿瘤特性的良性疾病，目前相关机制研究稀少，借此分析希望能进行初步探讨。综上所述，本研究初步探究了失笑散多成分、靶点和通路的多因素机制过程，为后续从失笑散中提取有效药物成分治疗子宫内膜异位症痛经提供了前提和依据。
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摘要
Abstract
Keywords
network pharmacology; Shixiao Powder; endometriosis; dysmenorrhea; mechanism; target
子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是指具有活性的子宫内膜组织在子宫内膜以外部位生长引起的一种疾病，本病最典型的症状是继发性、进行性加剧的痛经。EM的病理特征包括种植、侵袭及复发率高
失笑散化学成分复杂，已有药理研究证实失笑散在不同疾病中具有不同的作用，包括调节雌、孕激素水平,抑制异位组织瘢痕增生,抗血管生成和抗炎和改变血液流变
