1 材料与方法

1.1　实验动物

SPF级ICR雄性小鼠84只，体重25-28 g，购自南京江宁区青龙山实验动物繁育中心（合格证号：SCXK（苏）2017-0001），饲养于中国药科大学玄武校区药学动物实验中心清洁级动物房，并接受环境适应3 d，将动物保持在25 ± 2℃的环境温度和55 ± 2%的湿度下，在自由获取食物和水的条件下，进行12 h的光/暗循环。所有实验均在江苏省实验动物管理委员会和中国药科大学伦理委员会批准下进行。

1.2　实验药物

廿一味植物药是一种廿一味中药植物复方功能制剂，由广州隆赋脑多肽生物科技有限公司生产提供的成药（批号：190401）。

1.3　主要仪器与试剂

仪器：避暗穿梭一体机（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；Varioskan Flash全波长酶标仪（美国ThermoFisher）；氢溴酸东莨菪碱（上海皓元医药股份有限公司）；R500通用型小动物麻醉机（瑞沃德生命科技有限公司）；4℃离心机（美国ThermoFisher）；异氟烷气体麻醉剂（瑞沃德生命科技有限公司）；TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）、ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（谷草转氨酶）、LDH（乳酸脱氢酶）、α-HBDH（α-羟基丁酸脱氢酶）、CK（肌酸激酶）、UREA（尿素）等检测试剂盒均购自于上海科华生物工程股份有限公司；StepOnePlus实时荧光定量PCR仪（美国Life technologies公司）；RNA逆转录仪（美国Bio-Rad公司）；Nanodrop 2000核酸定量仪（美国ThermoFisher）；总谷胱甘肽检测试剂盒（碧云天）；脂质氧化（MDA）检测试剂盒（碧云天）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）；RNA逆转录试剂（诺唯赞）；内参18S rRNA引物、BDNF引物均购自于上海生工生物公司。

1.4　动物分组与给药

84只ICR小鼠中24只用于安全性试验，60只分成两批次用于学习记忆行为学测定。

24只小鼠每笼6只，适应环境3 d。适应后编号，称重，随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组，给药高、中、低剂量组。给药组高、中、低剂量分别为2 g·kg^-1，1 g·kg^-1，0.1 g·kg^-1，灌胃给药，称取廿一味植物药适量，溶于适量生理盐水，使每只小鼠的灌胃体积保持在0.2 mL左右，且随着小鼠体重的增加，调整灌胃药物的浓度；空白对照组等量的生理盐水，连续灌胃28 d。

30只小鼠每笼6只，适应环境3 d。适应后编号，称重，随机分为5组，每组6只，分别为空白对照组，模型组，给药高、中、低剂量组。给药方式同上，空白对照组及模型组给予等量的生理盐水，连续灌胃28 d，用于小鼠避暗实验。另外30只小鼠按照以上分组用于小鼠跳台实验。

1.5　安全性试验

每周称量小鼠的体重，统计体重变化差异。取血前使用R500通用型小动物麻醉机和异氟烷麻醉剂进行麻醉，2%-3%异氟烷诱导麻醉后，摘眼球取血1 mL，静置4 h，4℃，7000 g，离心20 min，取上部分血清，于-80℃冰箱保存。根据各试剂盒说明书测定各脏器毒性指标变化，其中肝脏毒性指标为谷丙转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG），心脏毒性指标为谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）及α-羟基丁酸脱氢酶（α-HBDH），肾脏毒性指标为尿素（UREA）；安乐死后取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑组织等器官，测定脏器系数，脏器系数 = 脏器重量/体重 × 100%；同时取各脏器进行H&E染色，观察组织病变情况。

1.6　行为学测试

1.6.1　小鼠避暗实验^[16]

连续灌胃28 d，末次给药1 h后，除空白对照组外各组（空白对照组腹腔注射生理盐水）腹腔注射东莨菪碱5 mg·kg^-1[17]，30 min后将小鼠背向洞口放入一体机的明室内，同时按下计时器开始计时。一体机分为两个相同体积的明、暗室体，明、暗室由一个洞口相连，小鼠有趋暗的习性，倾向于穿过洞口进入暗室，暗室接有40 V的电压，小鼠进入暗室受到电击后退回明室，并产生暗室有电的短暂性记忆。将每只小鼠训练5 min，并记录每只小鼠第一次进入暗室的潜伏期（开始放入明室到进入暗室受到电击的时间）及5 min内受到的电击次数。24 h后重新测试，记录每只小鼠第一次进入暗室的潜伏期和5 min内每只小鼠受到的电击次数。

1.6.2　小鼠跳台实验^[18]

连续灌胃28 d，末次给药1 h后，除空白对照组外（空白对照组腹腔注射生理盐水）各组腹腔注射东莨菪碱5 mg·kg^-1，30 min后将小鼠放入一体机平台上适应环境3 min，平台下接通40 V的电压。小鼠具有探索空间的习性，倾向于跳下平台进入铜栅上而受到电击，其正常反应是跳回平台躲避电击，但多数小鼠在第一次受到电击后会再次跳下平台，接着受到电击，在反复循环训练多次后，小鼠会产生铜栅有电的短暂记忆。将小鼠放在平台上，接上电源，同时按下计时器开始计时，记录各组小鼠第1次跳下平台的时间即潜伏期，以及每组小鼠3 min跳下平台受到电击的次数即错误次数。24 h后重新测试，记录每只小鼠第1次从平台跳下受到电击的潜伏期和3 min内的错误次数。

1.7　ICR小鼠海马组织BDNF mRNA、总谷胱甘肽、MDA的检测

实时荧光定量PCR检测海马组织BDNF mRNA表达。在行为学实验结束后，使用小型麻醉机和麻醉剂异氟烷麻醉小鼠，生理盐水灌流后，精密称取10 mg小鼠脑部海马组织，加入适量RNA提取试剂Trizol匀浆后提取RNA，使用核酸定量仪测定样品RNA的浓度；使用RNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，合成cDNA，然后进行扩增。引物由上海生工生物有限公司合成，内参18S rRNA引物序列为：上游引物（Forward）：CTTAGAGGGACAAGTGGCG；下游引物（Reverse）：ACGCTGAGCCAGTCAGTGTA；BDNF上游引物序列 （Forward）：TCATACTTCGGTTGCATG-AAGG；下游引物序列（Reverse）：AGACCTCTCGAACCTGCCC。扩增体系为20 μL，反应条件：95℃预变性5 min；95℃，10 s；60℃，30 s；共40个循环，反应结束后通过溶解曲线确认引物特异性，通过CT值计算目的基因相对表达量。另分别精确称取10 mg小鼠脑海马组织，加入相应的试剂盒匀浆液，制成10%的组织匀浆液；4℃，10 000 × g，离心10 min后取上清，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量组织裂解液蛋白浓度。根据总谷胱甘肽检测试剂盒、MDA检测试剂盒说明书分别检测其含量。

1.8　统计方法

采用GraphPad Prism 6统计软件进行统计学分析，所测表格数据以均值 ± 标准差（Mean ± SD表示，图数据以均值±标准误（Mean ± SEM）；各指标组间比较均采用单因素方差分析（One-way ANOVA），采用Bonferroni检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　安全性试验

2.1.1　给药前后各组小鼠体重比较

随着时间的变化，各组小鼠体重显著增加，而与空白对照组相比，给药高、中、低剂量组小鼠体重均无明显差异（P > 0.05）（表1）。

2.1.2　脏器系数

随着周龄的增长，ICR小鼠的脏器质量和体重在逐渐增加，各组小鼠的脏器系数（脏器系数 = 脏器重量/体重×100%）并无明显差异（P > 0.05）（图1）。

图1 小鼠的脏器系数

注：不同浓度廿一味植物药给药28 d对ICR小鼠脏器（A）脑、（B）心脏、（C）肝脏、（D）脾、（E）肺、（F）肾脏的重量影响，n = 6，结果表示为 Mean ± SEM

2.1.3　脏器毒性指标

与空白对照组相比，各浓度的廿一味植物药对肝脏毒性指标ALT、TC、TG，心脏毒性指标AST、LDH、CK、α-HBDH及肾脏的毒性指标UREA均未造成显著改变（P > 0.05）（图2）。

图2 小鼠的脏器毒性指标

注：不同浓度的廿一味植物药给药28 d对ICR小鼠各脏器指标（A）甘油三酯（TC）、（B）总胆固醇（TG）、（C）丙氨酸氨基转移酶（ALT）、（D）谷草转氨酶（AST）、（E）乳酸脱氢酶（LDH）、（F）α-羟基丁酸脱氢酶（α-HBDH）、（G）肌酸激酶（CK）、（H）尿素（UREA）的影响，n = 6，结果表示为Mean ± SEM

2.1.4　H&E染色结果

用苏木精和伊红（H&E）染色观察各脏器病理变化，发现心脏空白对照组小鼠心肌纤维排列规则，细胞核质均一，心肌细胞周围炎性细胞浸润少，给药高、中、低剂量组与正常组相比均无明显变化。肝脏空白对照组肝细胞形态完整，细胞核居中且大而圆，异染色质少而着色浅，可以看到明显核仁，肝小叶形态完整，给药组与对照组相比无明显变化。脾脏空白对照组结构正常，滤泡数量丰富，形态饱满，与空白对照组相比给药高、中、低剂量组均无明显变化。肺空白对照组支气管粘膜上皮及肺泡无变形，无细胞脱落，无炎性细胞渗出、聚集；与空白对照组相比，给药高、中、低剂量组均无明显变化。肾脏空白对照组镜下可见结构形态正常，肾小球数量丰富，形态饱满；与空白对照组相比，给药高、中、低剂量组均无明显变化。脑空白对照组皮层部位神经元形态规则，数量丰富，排列整齐；与空白对照组相比，给药高、中、低剂量组均无明显变化（图3）。

图3 小鼠各脏器的H&E染色切片

注：不同浓度的廿一味植物药给药28 d后ICR小鼠各脏器（从上至下脏器依次为心、肝、脾、肺、肾、脑）组织的H&E切片（× 40）

2.2　廿一味植物药改善小鼠记忆获得障碍的作用分析

2.2.1　避暗试验结果

实验结果表明，与空白对照组相比，造模组小鼠的记忆潜伏期显著地缩短（P <0.001），5 min内的错误次数显著增加（P < 0.001），表明造模成功。而与模型组小鼠相比，廿一味植物药低剂量组小鼠的记忆潜伏期显著延长（P < 0.01）；高、中剂量组小鼠的记忆潜伏期极显著延长（P < 0.001），且各剂量组小鼠的错误次数显著减少（P < 0.01）（表2）。

2.2.2　跳台试验结果

实验结果表明，与空白对照组相比，造模组小鼠的记忆潜伏期明显缩短（P < 0.001），错误次数显著增加（P < 0.001），说明造模成功。而与模型组相比，廿一味植物药高、中、低剂量组小鼠潜伏期显著延长（P < 0.001），错误次数显著减少（P < 0.001）。这些结果说明廿一味植物药可改善东莨菪碱引起的记忆获得障碍（表3）。

2.3　廿一味植物药对记忆障碍小鼠脑海马BDNF mRNA、总谷胱甘肽、MDA的含量测定

与空白对照组比较，模型组BDNF mRNA、总谷胱甘肽、MDA含量出现明显改变。与模型组相比，廿一味植物药中、高剂量组BDNF mRNA和总谷胱甘肽含量显著升高（P < 0.01）、MDA含量显著降低（P <0.001）（图4）。

图4 小鼠海马组织BDNF mRNA、总谷胱甘肽、MDA的含量测定

注：不同浓度的廿一味植物药给药28 d后对ICR小鼠脑海马组织（A）BDNF mRNA、（B）总谷胱甘肽、（C）MDA的含量影响，n = 6，结果表示为Mean ± SEM。和Control组相比较，^*P < 0.05，^***P < 0.001；和Model组相比较，^#P < 0.05，^##P < 0.01，^###P < 0.001

3 讨论

学习记忆是脑的高级功能之一，是衡量动物智力发育的重要指标^[19]。学习记忆是通过神经系统一系列生理生化过程实现的，其作用减退可能与脑胆碱能系统损伤及氧化应激有关^[20]，改善记忆功能是预防阿尔兹海默症的重要手段。

现阶段，对于治疗AD患者的药物主要有神经保护药、抗氧化药、抗炎症药物等。但是，这些药物只能从单方面进行治疗，进而改善记忆作用，而且其副作用大，药物昂贵。由于阿尔兹海默症病理机制复杂，具有多靶点多途径的特点，因此使用中药复方制剂可以在治疗效果方面具有更高的优势。本研究利用中药制剂的多种有效成分协同发挥作用，使改善记忆效果达到最佳，符合中医药治疗特色。

廿一味植物药中有多种成分具有益智健脑的作用，其中肉桂中的主要成分肉桂醛能够显著改善大脑功能，有助于记忆力的提升^[21]；桃仁能够显著改善脑血流量，从而提高记忆能力^[22]；金针菇多糖可以通过调节肠道菌群起到改善记忆功能的作用；人参具有大补元气，补脾益肺，生津，安神的作用，其主要成分人参皂苷具有益气补脑的作用^[23]。茯苓味甘、淡、性平，入药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神之功用。几味药物合用，可达到舒张脑部血管，改善脑功能的作用。

胆碱能功能障碍是AD患者记忆损伤的主要原因之一^[24]。东莨菪碱是一种M胆碱能受体阻断剂，阻断脑乙酰胆碱（Ach）生成，抑制大脑信息的传递，从而模拟AD的记忆受损症状，目前常用做开发AD或记忆障碍药物的动物模型。避暗实验和跳台实验为经典的行为学检测方法^[25]，避暗实验是利用小鼠具有趋暗避明的习性而设计的一种实验，而跳台实验是利用小鼠具有探索空间的能力而设计的一种实验，两者都可以用于评估恐惧驱动的记忆检索^[26]。本研究预防性给药28 d，采用东莨菪碱引起小鼠记忆获得性障碍，采用避暗实验和跳台实验进行模型及给药效果的比较。实验结果表明，避暗实验和跳台实验中模型组小鼠进入暗室及跳下平台的潜伏期明显缩短，且进入暗室及跳下平台的错误次数明显增加。廿一味植物药高、中、低剂量都能显著延长未成年小鼠进入暗室的潜伏期，减少小鼠的错误次数，改善东莨菪碱引起的记忆获得性障碍，提高小鼠的学习记忆能力；且早期安全性研究发现，在小鼠各脏器方面，廿一味植物药高、中、低剂量都无毒副作用。

BDNF^[27]是一种脑源性神经营养因子，BDNF及其受体在神经系统中广泛存在，具有神经营养、保护神经的作用。总谷胱甘肽^[28]包括还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，其中还原型谷胱甘肽是动物细胞中关键的抗氧化剂，而总谷胱甘肽中通常有90-95%为还原型谷胱甘肽。MDA是生物体脂质氧化的产物，细胞发生氧化应激时会发生脂质氧化。因此可以通过检测MDA的含量反应细胞氧化应激的水平。实验结果表明，廿一味植物药高、中剂量组可以显著增加BDNF mRNA的含量，起到脑神经保护作用；同时廿一味植物药高、中剂量组也能显著增加总谷胱甘肽的含量，降低MDA的含量，进一步证明廿一味植物药改善学习记忆作用可能是通过增加脑内神经营养因子和抗氧化发挥作用，其具体的作用分子机制有待进一步研究。

廿一味植物药是我们目前进行研究的一组方剂，通过以上的研究显示出其具有一定的记忆改善作用，但由于本方剂中含有药物种类较多，无法分析是由于哪种或哪几种药物起到提升记忆的作用。因此，在今后的实验中，我们将会对本方剂中的一种或几种不同药物的配伍进行提升记忆力的研究，并寻找有效物质成分，期待能够找到更好的改善记忆的方剂或药效物质，为改善记忆障碍相关脑疾病提供理论和实验基础。

综上所述，廿一味植物药能够显著减轻东莨菪碱引起的记忆障碍，在灌胃给予2 g·kg^-1时仍未表现出毒副作用，具有良好的安全性，而且其作用效果可能与神经保护和抗氧化有密切关系，值得临床前深入开发研究。

参考文献